Bosch PPS8 C2 Series Instrukcja Użytkownika Strona 107
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4. ZUSAMMENFASSUNG 106
4 Zusammenfassung
Aufgabe dieser Arbeit war die Klonierung, Expression und Reinigung der Lipase aus
Rhizopus oryzae (ROL) in aktiver Form.
Die Lipase aus Rhizopus oryzae konnte in der Vergangenheit in E. coli erfolgreich in Form
inaktiver Einschlußverbindungen exprimiert werden. Um daraus die aktive Lipase zu erhalten,
mußte diese durch eine teure und aufwendige Rückfaltungsprozedur renaturiert werden. Da-
durch ist dieses Expressionssystem trotz guter Ausbeuten nur für Kultivierungen in kleinem
Maßstab geeignet. Um dieses Problem zu umgehen, sollte das Expressionssystem gewechselt
werden.
Ein häufig verwendeter Organismus zur Expression heterologer Proteine ist die Bäckerhefe
Saccharomyces cerevisiae. In der vorliegende Arbeit wurde die für die ROL kodierende Gen-
sequenz zusammen mit dem α-Faktor zur Proteinsekretion in das Plasmid pYes unter Kon-
trolle des Galaktosidasepromotors pGal kloniert. Die Transformation und Kultivierung der
Hefe wurde erfolgreich durchgeführt, jedoch blieben die Ausbeuten an aktivem Protein weit
hinter den Erwartungen zurück. Da die Hefe Pichia pastoris dafür bekannt ist, heterologe
Proteine mit höheren Ausbeuten zu exprimieren als Saccharomyces cerevisiae, wurde die
ROL in die Vektoren pPICZαA, sowie pGAPZαA kloniert. Beide Vektoren sind Pichia
pastoris/E. coli-Schaukelvektoren; einer unter Kontrolle des induzierbaren pAOX1 Pro-
motors, der andere unter Kontrolle des konstitutiven pGAP Promotors der Hefe Pichia
pastoris. Die Plasmide konnten erfolgreich in den Pichia Stamm GS115 transformiert wer-
den. Die Anzahl der Transformanten war jedoch außerordentlich gering (in der Regel <10
Klone pro Transformation). Daraufhin wurden verschiedene Transformationsprotokolle unter-
sucht und schließlich eine geeignete Variation selbst entwickelt. Basierend auf der Elektro-
porationsmethode von Invitrogen konnten mit dieser Methode bis zu 100-200 positive Klone
pro Transformation erhalten werden.
Bei allen Kolonien konnte auch Lipaseaktivität nachgewiesen werden. Die Expressionraten
bei Kultivierungsversuchen in Schüttelkolben zeigten jedoch erstaunliche Unterschiede. Es
wurden jeweils die Klone selektiert, die pro gemessener OD
600
die größte Aktivität aufwiesen
und diese wurden zur Kultivierung verwendet.
- Strukturbestimmung 1
- Stefan Minning 1
- PETER HØEG 2
- Danksagung 3
- INHALTSVERZEICHNIS 3 4
- INHALTSVERZEICHNIS 5 6
- INHALTSVERZEICHNIS 7 8
- INHALTSVERZEICHNIS 8 9
- ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9 10
- ABBILDUNGSVERZEICHNIS 10 11
- TABELLENVERZEICHNIS 11 12
- BKÜRZUNGSVERZEICHNIS 12 13
- BKÜRZUNGSVERZEICHNIS 13 14
- 1 Einleitung 15
- INLEITUNG 15 16
- INLEITUNG 16 17
- INLEITUNG 17 18
- INLEITUNG 18 19
- INLEITUNG 19 20
- INLEITUNG 20 21
- INLEITUNG 21 22
- INLEITUNG 22 23
- INLEITUNG 23 24
- INLEITUNG 24 25
- INLEITUNG 25 26
- INLEITUNG 26 27
- 1. EINLEITUNG 27 28
- Glyceridestern 28
- INLEITUNG 28 29
- 1.2 Expressionssysteme 30
- INLEITUNG 30 31
- INLEITUNG 31 32
- INLEITUNG 32 33
- INLEITUNG 33 34
- 1.3 Proteinreinigung 35
- INLEITUNG 35 36
- INLEITUNG 36 37
- INLEITUNG 37 38
- INLEITUNG 38 39
- INLEITUNG 39 40
- 1.4 Aufgabenstellung 41
- 2 Ergebnisse 42
- RGEBNISSE 42 43
- RGEBNISSE 44 45
- RGEBNISSE 46 47
- RGEBNISSE 48 49
- RGEBNISSE 49 50
- RGEBNISSE 50 51
- RGEBNISSE 51 52
- RGEBNISSE 54 55
- Zeit (h) 56
- RGEBNISSE 56 57
- RGEBNISSE 57 58
- RGEBNISSE 58 59
- Aktivität (U ml 60
- MeOH (g l 60
- RGEBNISSE 60 61
- RGEBNISSE 61 62
- RGEBNISSE 62 63
- RGEBNISSE 63 64
- RGEBNISSE 64 65
- RGEBNISSE 65 66
- RGEBNISSE 66 67
- RGEBNISSE 67 68
- RGEBNISSE 68 69
- RGEBNISSE 69 70
- (P. pastoris)E F S D G G 71
- RGEBNISSE 71 72
- Temperatur (°C) 73
- RGEBNISSE 73 74
- RGEBNISSE 74 75
- RGEBNISSE 75 76
- Fluoreszenz 77
- Relative GFP Konzentration 77
- RGEBNISSE 77 78
- 2. ERGEBNISSE 78 79
- Ende des EGFP 79
- RGEBNISSE 79 80
- RGEBNISSE 80 81
- RGEBNISSE 81 82
- RGEBNISSE 82 83
- RGEBNISSE 83 84
- RGEBNISSE 84 85
- RGEBNISSE 85 86
- RGEBNISSE 86 87
- (HeliTagX 88
- HeliTag M13 89
- RGEBNISSE 89 90
- 3 Diskussion 91
- ISKUSSION 91 92
- ISKUSSION 92 93
- ISKUSSION 93 94
- ISKUSSION 94 95
- ISKUSSION 96 97
- Pichia pastoris 98
- ISKUSSION 98 99
- ISKUSSION 99 100
- ISKUSSION 100 101
- ISKUSSION 101 102
- ISKUSSION 102 103
- ISKUSSION 103 104
- ISKUSSION 104 105
- ISKUSSION 105 106
- 4 Zusammenfassung 107
- USAMMENFASSUNG 107 108
- 5 Material & Methoden 109
- 5.2 Chemikalien 110
- 5.3 Verwendete Plasmide 110
- Sequenz (5´ → 3´) 111
- Verwendung 111
- ATERIAL & METHODEN 111 112
- ATERIAL & METHODEN 112 113
- ATERIAL & METHODEN 113 114
- ATERIAL & METHODEN 114 115
- ATERIAL & METHODEN 115 116
- ATERIAL & METHODEN 116 117
- ATERIAL & METHODEN 117 118
- ATERIAL & METHODEN 118 119
- ATERIAL & METHODEN 119 120
- ATERIAL & METHODEN 120 121
- ATERIAL & METHODEN 121 122
- ATERIAL & METHODEN 122 123
- ATERIAL & METHODEN 123 124
- ATERIAL & METHODEN 124 125
- ATERIAL & METHODEN 125 126
- Pfu DNA 127
- Polymerase 127
- XL1-Blue 127
- ATERIAL & METHODEN 127 128
- 5.7 Arbeiten mit Proteinen 129
- ATERIAL & METHODEN 129 130
- ATERIAL & METHODEN 130 131
- 5.8 Proteinreinigung 132
- ATERIAL & METHODEN 132 133
- 5.10 Aktivitätstests 134
- ATERIAL & METHODEN 134 135
- 6 Literatur 136
- ITERATUR 136 137
- ITERATUR 137 138
- ITERATUR 138 139
- ITERATUR 139 140
- ITERATUR 140 141
- ITERATUR 141 142
- ITERATUR 142 143
- ITERATUR 143 144
- ITERATUR 144 145
- ITERATUR 145 146
- ITERATUR 146 147
- ITERATUR 147 148
- ITERATUR 148 149
- ITERATUR 149 150
- ITERATUR 150 151
- 6. LITERATUR 151 152
- Lebenslauf 153
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