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1. EINLEITUNG 40

1.4 Aufgabenstellung

Die Lipasen aus der Familie Rhizopus sind wertvolle Biokatalysatoren, insbesondere in der

Fettmodifikation. Dabei entscheidend ist die außerordentlich hohe 1,3-Regioselektivität. Aber

auch für die Schützung und Entschützung von Aminosäuren und Zuckern wurden sie erfolg-

reich eingesetzt.

Die Lipase aus Rhizopus oryzae konnte in einer vorangehenden Arbeit in Escherichia coli im

Labormaßstab hergestellt werden. Um die Lipase in größerer Menge herstellen zu können, ist

die Expression in E. coli jedoch ungeeignet, da das Protein nur als inaktive Einschluß-

verbindungen exprimiert wird, die in einem teuren und aufwendigen Rückfaltungsprozeß in

vitro renaturiert werden müssen.

Zur Expression und Sekretion von korrekt gefalteten Proteinen in größerer Menge bieten sich

Hefen an. Das Standard Expressionssystem hierbei ist die Bäckerhefe Saccharomyces

cerevisiae. Heutzutage werden aber auch eine ganze Reihe anderer Hefen zur Expression von

Proteinen verwendet, die gegenüber Saccharomyces durch eine höhere Expressionsleistung,

sowie eine moderatere Glykosylierung im Vorteil sind.

Ziel dieser Arbeit war die Expression der Lipase aus Rhizopus oryzae in aktiver Form in der

Hefe Pichia pastoris zur Bereitstellung dieses wertvollen Biokatalysators für Anwendungen

in der Fettmodifikation und Biotransformation. In diesem Zusammenhang wurden ver-

schiedene auf Computersimulationen basierende Mutanten hergestellt und zur Untersuchung

der Regioselektivität gegenüber Triglyceridanaloga und der Enantioselektivität von

Reaktionen mit primären und sekundären Alkoholen bereitgestellt.

Durch die Optimierung der Kultivierungsbedingungen sollte eine möglichst hohe Ausbeute an

aktivem Protein erzielt werden, aber auch allgemeine Erkenntnisse über die Fermentation

dieser Hefe zur optimalen Proteingewinnung erhalten werden. Die Etablierung der Kultivie-

rung in vollsynthetischem Medium sollte die Möglichkeit der Isotopenmarkierung mit ent-

sprechenden N- oder C-Quellen ermöglichen, um damit dynamische Untersuchungen bezüg-

lich ihrer Stereo- oder Regioselektivität zu erlauben.

Der zweite Teil der Arbeit sollte sich mit der Proteinaufreinigung beschäftigen. Es sollte eine

Möglichkeit gefunden werden, Proteine einfach - in möglichst einem Schritt - aus Zelllysaten

oder Kulturüberständen aufreinigen zu können. Dabei sollte eine verbesserte Alternative zu

dem bekannten und durch Patente geschützten His-Tag gefunden werden.

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