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3. DISKUSSION 94

Gehalts detektiert werden. Die darauf folgende Zugabe von Methanol führte zum unmittel-

baren Absinken des DO. Außerdem wurde vor der Induktion mit Methanol Glycerin (1 %

(v/v)) zugegeben, um die Zellmasse zu erhöhen. Mit dieser vergleichsweise einfachen Strate-

gie konnte die Ausbeute an aktiver Lipase (Aktivität 500 U ml

-1

) gegenüber der Zugabe von

Methanol alle 24 h nahezu verfünffacht werden.

Die Kultivierung in komplexem Vollmedium ist jedoch teuer. Um die Kosten für die ROL

Produktion zu verringern, die Markierung der ROL mit verschiedenen Isotopen zu ermögli-

chen (Laroche, et al. 1994, Wood und Komives 1999) und die Ausbeute weiter zu steigern,

wurde ein definiertes synthetisches Minimalmedium verwendet.

Die bei Fermentation 3 erfolgreich angewendete Fütterungsstrategie (Fütterung bei Absinken

des DO-Wertes) sollte auf die anschließende Fermentation in synthetischem Medium über-

tragen werden. Hierbei stellte sich heraus, daß mit der Batch-Fütterung, abhängig vom DO-

Gehalt, keine oder nur eine minimale Lipaseaktivität im Medium nachgewiesen werden

konnte (nicht gezeigt). Deshalb wurden die weiteren Fermentationen mit kontinuierlicher

Fütterung von Methanol durchgeführt.

In Fermentation 4 wurde ein vom Hersteller (Invitrogen) vorgeschlagenes Profil für die Fütte-

rung übernommen. Gleichzeitig wurde untersucht, ob auch in diesem Fall die Methanol-

Konzentration in der Lösung mit dem im Fermenter gelösten Sauerstoff korreliert werden

kann, wie bei Fermentation 3 beschrieben.

Die Analyse des Methanolgehaltes der Proben im GC zeigte jedoch, daß die DO-Werte zum

Teil anstiegen, obwohl die tolerierbare Methanol-Konzentration der Kulturbrühe von 1 %

(v/v) überschritten war. Dieser Parameter konnten also bei den vorliegenden Pichia pastoris

Transformanten mit Mut

-Phänotyp (siehe oben) nicht zur Steuerung der Fütterungsrate ver-

wendet werden, obwohl das für Mut

-Phänotyp beschrieben wurde (Stratton, et al. 1998). Da

im Verlauf der Fermentation Methanolkonzentrationen bis zu 1,6 % (v/v) auftraten, konnte

am Ende der Fermentation nur 120 U ml

-1

Lipaseaktivität im Überstand erhalten werden.

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Brak uwag

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