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2. ERGEBNISSE 74

deutliche Präferenz der rekombinanten Lipase zu Triglyceriden mit Fettsäuren mittlerer

Kettenlänge.

2.3.4 Mutagenese der ROL zur Modifikation der Stereopräferenz gegenüber

Triacylglycerin Analoga

Wie in Kapitel 1.1.5.2 beschrieben wurde von Scheib et al. L258 als entscheidende Amino-

säure bei der Stereoselektivität der ROL gegenüber Triglycerin Analoga identifiziert und

diese gegen F, A und S ausgetauscht und untersucht. Bei weiterführenden Molekular Model-

ling Untersuchungen wurden von Scheib et al. zwei weitere ROL-Mutanten vorgeschlagen,

die einen noch stärkeren Effekt auf die Stereopräferenz der ROL gegenüber den Triacyl-

glycerin Analoga zeigen sollten; L258Y und L258W (H. Scheib, persönliche Mitteilung).

Außerdem konnten Hinweise darauf gefunden werden, daß diese Mutanten Verbesserungen

bei der Racematspaltung von primären und sekundären Alkoholen erbringen könnten.

Ausgehend vom Plasmid pPICZαAROL wurden die zwei Mutanten durch die Quikchange

Methode erzeugt. Je fünf positive Klone wurden selektiert und die aus ihnen isolierten

Plasmide auf die Anwesenheit der gewünschten bzw. Abwesenheit von unerwünschten

Mutationen untersucht. Es konnten für beide Mutanten je ein Plasmid gefunden werden, das

diese Voraussetzungen erfüllte (pPICZαAROL_L258W und pPICZαAROL_L258W). Das

weitere Vorgehen verlief analog zum Wildtyp (siehe Kapitel 2.1.3). Die Plasmide wurden

erfolgreich in Pichia pastoris X-33 transformiert. Die Kultivierung von je zwei selektierten

Klonen in Schüttelkolben ergab eine Aktivität von 50 U ml

-1

für (L258W) und 45 U ml

-1

für

(L258Y). Die erzeugten Mutanten stehen nun zur Untersuchung ihrer Stereopräferenz

gegenüber Triacylglycerin Analoga zur Verfügung. Die entsprechenden Untersuchungen

werden im Rahmen einer Kooperation von einer Gruppe der Universität Lund, Schweden

durchgeführt und stehen zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch aus.

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