
2. ERGEBNISSE 75
2.4 Entwicklung eines Peptid-tags aus der Nickelbindungsstelle der
ATPase 439 aus Helicobacter pylori (HeliTag)
2.4.1 Variation und Klonierung der Nickelbindungsstelle aus der ATPase 439 aus
Helicobacter pylori an EGFP
2.4.1.1 Herstellung der Peptid-Bibliothek
Eine ideale Bibliothek von Peptiden setzt voraus, daß jede mögliche Abfolge von Amino-
säuren mindestens einmal vorkommt und keine starke Bevorzugung bestimmter Sequenzen
auftritt. Bei einem Tag mit einer Länge von zehn Aminosäuren ergeben sich also 20
10
ver-
schiedene Peptide. Man kann jedoch durch Konservierung einzelner wichtiger Stellen den
Aufwand für das Screening deutlich reduzieren.
Anstatt völlig zufällige Peptidsequenzen zu verwenden, wurde die Metallbindungsstelle
(WtHeliTag) einer ATPase aus dem human-pathogenen Stamm Helicobacter pylori (siehe
Kapitel 1.3.2.5) als Matrix verwendet. Diese wurde von Volz et al. (Volz, et al. 1998) durch
massenspektrometrische Untersuchungen sowie dem Sequenz-Vergleich verschiedener
Metallbindungsstellen identifiziert. Durch die Verwendung dieser Konsensussequenz konnten
die variablen Aminosäuren auf sechs reduziert werden.
Die einfachste und schnellste Möglichkeit, um einen solchen Tag an ein Reporterprotein zu
fusionieren, ist eine PCR, in der degenerierte Wobble-Primer verwendet werden. Bei der
Synthese der Wobble-Primer wird an den gewünschten Stellen ein Gemisch der dNTP´s ver-
wendet.
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