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1. EINLEITUNG 31

1.2.2 Verwendung von Pichia pastoris als Expressionssystem

1.2.2.1 Entwicklung von Pichia pastoris zu einem Expressionssystem für heterologe

Proteine

Die von Philipps Petroleum entwickelte Hefe Pichia pastoris sollte ursprünglich für die

Produktion von single-cell Protein eingesetzt werden (Wegner 1983). Trotz beachtlicher

Wachstumsraten von 10 g l

-1

, Ausbeuten bis zu 130 g l

-1

Trockenzellen in der

Fermentationsbrühe und dem geringen Preis von 5 $ pro kg Protein (Stand 1983) konnte sich

das System wirtschaftlich nicht gegen den Einsatz von Sojabohnen durchsetzen. Aus diesem

Grunde wurde die Hefe zum Expressionssystem für heterologe Proteine weiterentwickelt

(Cregg 1999, Cregg, et al. 1993, Romanos, et al. 1992, Sreekrishna und Kropp 1996).

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris kann mit Methanol als einziger C-Quelle überleben.

Damit verbunden ist die Oxidation von Methanol zu Formaldehyd in der Zelle. Diese Reak-

tion findet in einer speziellen Zellorganelle, dem Peroxisom statt und wird von einer Alkohol-

oxidase (AOX1) katalysiert. Die Affinität von AOX1 zu Methanol ist nur schwach ausge-

prägt, zur Kompensation muß die Hefe das Enzym in großen Mengen produzieren. AOX1 ist

bei Verfügbarkeit von z. B. Glycerin oder Glukose nur marginal in der Zelle vorhanden, kann

jedoch mit Methanol als einziger C-Quelle bis zu 30 % des Gesamtzell-Proteins ausmachen

(Sreekrishna und Kropp 1996). Deshalb wurde der Promotor, der die Expression dieses

Enzyms reguliert, verwendet, um heterologe Proteine zu exprimieren.

Zusätzlich zu Vektoren, die auf dem induzierbaren AOX Promotor basieren,wurde auch ein

konstitutiver Vektor mit dem Promotor der Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

(GAPDH) entwickelt (Waterham, et al. 1997). Eine Diskussion der Vor- und Nachteile der

beiden Promotoren für die Produktion von ROL findet sich in den Kapiteln 2.1.2 und 2.1.3.

Alle zur heterologen Expression verwendeten Pichia pastoris Stämme leiten sich von einem

Stamm (NRRL Y-11430) ab (Reviewed in: (Cregg 1999, Higgins und Cregg 1998)). In der

Vergangenheit wurde am häufigsten der Stamm GS115 verwendet. Dieser auxotrophe Stamm

wurde durch die Deletion des für die Histidinoldehydrogenase kodierenden Gens aus dem

His4 Locus hergestellt, d. h. durch Unterbrechung der Histidin Biosynthese kann er auf

Mangelmedium nur durch die Zugabe von Histidin kultiviert werden. Die Expressions-

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Brak uwag

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